安排样本的免疫荧光主要有两种制备办法：白腊切片和冰冻切片。两者各有好坏，适用场景也大不相同。

  安排样本的免疫荧光主要有两种制备办法：白腊切片和冰冻切片。两者各有好坏，适用场景也大不相同。

  白腊切片免疫荧光(Paraffin section)虽在安排形状保存和长时刻贮存方面具有优势，但其制备进程触及高温烘烤、二甲苯脱蜡等进程[1][2]，容易构成某些灵敏蛋白(如细胞外表受体、细胞因子、磷酸化蛋白等)的抗原表位被损坏或掩蔽，使得抗体“认不出”方针蛋白，构成假阴性。此外，白腊切片的制备周期较长，不适用于医学病理检测等场景。

  相比之下，冰冻切片免疫荧光(Frozen section immunofluorescence)直接将新鲜或快速冷冻的安排置于低温度的环境下进行切片。这一进程极大地缩短了制片时刻，一起保存了安排中的多种抗原免疫活性。免疫荧光技能则进一步运用荧光符号的抗体与安排中的特定抗原结合，经过荧光显微镜调查，完结对抗原的准确定位和可视化[3]。

  首要，当检测灵敏蛋白/低表达抗原时，白腊切片的高温、二甲苯脱蜡等进程，会导致灵敏蛋白抗原表位变性，让抗体没办法辨认。冰冻切片低温冷冻、不触摸高温文有机溶剂，能保存抗原免疫活性，对细胞外表受体、磷酸化蛋白等灵敏抗原的检测灵敏度远高于白腊切片。此外，宝贵、难重复选材的安排样本也适宜冰冻切片。

  其次，在应急确诊/手术中快速确诊时，白腊切片制备需 2-3 天，不足以满意应急需求。冰冻切片 30 分钟内可完结包埋切片，1-2 小时完结染色，是手术切缘判别、急性病变确诊的首选，能为临床决议计划及时供给相关根据[1]。

  此外，在进行多抗原共定位剖析时——白腊切片：不同抗原修正条件纷歧，易出现修正不均问题；冰冻切片：无需抗原修正，可一起孵育多种一抗，完结多通道荧光符号，明晰出现多种抗原的空间散布联系。

  快速取出新鲜安排(如小鼠脑、肝、肾等)，用 1xPBS 冲刷去除血迹，浸没在 4% PFA，放在 4℃ 固定 12-24 小时。

  随后将固定后的安排转移至 15% 蔗糖溶液(4℃)，待其彻底沉底(约数小时)；转入 30% 蔗糖溶液(4℃)，持续孵育直至再次彻底沉底(一般过夜)，意图是为了脱去水分；

  取出沉底的安排，用滤纸悄悄吸干外表剩余水分。放入包埋模具中，用足量的 OCT 包埋剂彻底掩盖安排，保证没有气泡。接着敏捷放在干冰或液氮气相层进行速冻，直至构成白色硬块，取出后可当即放入 -80℃ 冰箱保存，或直接用于切片。

  提早将 OCT 包埋块放入冷冻切片机腔体(温度 -20℃ 左右)，平衡 30 分钟。

  修整安排外表，设置切片厚度(一般 5-10 μm)。滚动切片机轮盘，辅以防卷板，接连平坦切片并贴附在防脱载玻片上，置于室温晒干 30-60 分钟后贮存于 -80℃ 或许直接进行下一步。

  将切片用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min，意图是为了去除切片外表的 OTC，再甩去剩余液体，在安排周围用疏水笔画圈，并向安排参加关闭液(5% 正常山羊血清或 5% BSA+ 0.3% Triton X-100)，室温孵育 1 h。

  吸去关闭液，当即在安排部分滴加适宜份额的一抗，保证整个安排都掩盖。将载玻片放回湿润的盒子里，4℃ 冰箱过夜。接着取出后先放复温至室温，用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min。

  再滴加荧光符号的二抗，室温避光孵育 1 h。用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min。

  尽量吸干玻片上剩余的水分，在样品处滴加含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片进行封片，尽量扫除气泡。室温通风晒干 2-4 小时，或 4℃ 避光保存过夜。

  运用荧光显微镜或共聚集显微镜调查并摄影。图片可用 ImageJ 软件做多元化的剖析处理。

  解决方案：延伸关闭时刻；二抗种属来历共同或运用；操作的流程坚持安排样品湿润。

  解决方案：保证 30% 蔗糖彻底沉底；包埋时用液氮/干冰速冻；封片保证气泡悉数去除。

  (1) 如需做惯例病理、长时刻存档、不灵敏抗原检测，选白腊切片，省心又安稳；

  (2) 如需做灵敏抗原、低表达抗原、术中快速确诊，选冰冻切片，精准又高效。

  冰冻切片免疫荧光的中心优势是“保存抗原活性”，这是白腊切片无论如何优化都难以代替的。虽然冰冻切片进程略多，但只需把握正确办法，避开常见坑，就可取得试验顺畅！